ICSI-Ergebnisse in Abhängigkeit von den Variationsmöglichkeiten der Spermatozooninjektion
[O. Drost, A. v. Stutterheim und E. H. Schmidt, Frauenklinik des Ev. Diakoniekrankenhauses Bremen, Akademisches Lehrkrankenhaus der Universität Göttingen]

Vorwort
Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluß der Art der Spermatozooninjektion auf die Fertilisationsrate zu untersuchen. Ausgewertet wurden die ersten 100 an unserem Zentrum durchgeführten ICSI-Zyklen. An insgesamt 904 untersuchten Oozyten (davon 89,7% reife Metaphase-II-Oozyten) konnten wir eine Fertilisationsrate von 58,1%, eine Transferrate von 93% und eine klinische Schwangerschaftsrate von 23,7% pro Transfer feststellen. 502 der 796 Mikroinjektionen verliefen ohne sichtbaren Fehler, was zu einer Fertilisationsrate von 62% führte. Bei 96,2% fand die Injektion mit PVP (Fertilisationsrate 59%) und bei 3,8% mit Ham’s F10 (Fertilisationsrate 34,5%) statt. 75,7% der Eizellen waren nach Injektionen mit großer Zytoplasmaaspiration fertilisiert. Dagegen betrug die Fertilisationsrate bei mehrfacher Zytoplasmaaspiration 50%. Eine niedrige Fertilisationsrate von 32% konnten wir bei mehrfacher Oolemmapenetration nachweisen. Nach ICSI mit einem PVP- oder Ham’s F10-Fleck im Ooplasma zeigte sich eine Fertilisationsrate von 51,7%. Trat bei der Injektion das Invaginationsphänomen auf, stieg die Fertilisationsrate auf 71%. Sie fiel aber bei Berührung des gegenüberliegenden Oolemmas auf 41,7%. Der Anteil der degenerierten Eizellen nach der Mikroinjektion betrug 6,2%. Von den 238 transferierten Präembryonen konnten den einzelnen Qualitätsgraden von I bis V 21,4% Grad I, 45,4% Grad II, 20,2% Grad III, 5,5% Grad IV und 7,6% Grad V zugeordnet werden.

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Einleitung
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) stellt seit Anfang der 90’er Jahre eine vielversprechende Alternative zur herkömmlichen In-vitro-Fertilisation (IVF) bei erheblicher andrologischer Subfertilität dar [3, 16]. Im Vergleich zu anderen Techniken der assistierten Fertilisation, wie Zonadrilling (ZD), partieller Zonadissektion (PZD) oder subzonaler Insemination (SUZI) ist die ICSI zur Zeit die erfolgreichste Behandlungsmethode. Klassische IVF oder ähnlichen Methoden sind nur dann erfolgversprechend, wenn die Spermatozoen bestimmte Mindestanforderungen erreichen (bei IVF mindestens 200.000 progressiv mobile, gereinigte Spermien pro Eizelle). Aber auch bei der ICSI bestehen gewisse Mindestanforderungen hinsichtlich der Spermatozooninjektion, um eine gute Fertilisations-, Transfer- und Schwangerschaftsrate zu erzielen. Diese Arbeit stellt die für uns auffälligsten Variationsmöglichkeiten bei der Mikroinjektion bei unseren ersten 100 Behandlungszyklen zusammen. Untersucht wurde der Einfluß von Spermatozooninjektionen mit großer und mehrfacher Zytoplasmaaspiration und mit nicht vollständig immobilisierten Spermatozoen sowie mit Spermatozoen, bei denen durch die Immobilisierung der Schwanz geknickt wurde. Ebenso sollen hier Injektionen, wobei das Spermatozoon mit dem Schwanz voran eingebracht wurde, und der Einfluß von der Art des benutzten Injektionsmediums dargestellt werden. Beschrieben werden ebenfalls die Auswirkungen der mehrfachen Oolemmapenetration, der Oolemmaberührung auf der Gegenseite der Oozyte und das Invaginationsphänomen bei der Injektion.

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Material und Methode
Der Untersuchungszeitraum erstreckte sich von Januar bis August 1996. Für die ICSI wurde in 100 Behandlungszyklen die ovarielle Stimulation mit dem langen Protokoll durchgeführt. Hierbei erhielten die Patientinnen ab dem 20. Zyklustag im Vorzyklus eine tägliche GnRH-Analogon-Injektion (Triptorelinacetat als Decapeptyl 0,1® (Ferring/Tosse)). 2 Wochen nach Spritzenbeginn begann dann die ovarielle Stimulation. Stimuliert wurde mit HMG (Pergonal® (Serono)), FSH (Fertinorm HP® (Serono)) oder rekombinantem FSH (Gonal F® (Serono)), in der Regel mit 150 IE täglich. Die HCG-Applikation (10.000 IE Pregnesin® (Serono)) erfolgte bei einem Durchmesser der Führungsfollikel ab 20 mm 36 Stunden vor der ultraschallgesteuerten vaginalen Follikelpunktion.
Die gewonnenen Oozyten kamen in mit 5% CO2 bei 37°C begastes Ham’s F10-Medium (IVF-Medium (Gück)). Nach ca. 3 Stunden wurden die Oozyten freipräpariert, d.h., es wurden mit Hirschmann-Kapillaren die Cumulusmasse und die Coronarzellen entfernt. Dies erfolgte durch ein Eizellbad von 30 Sekunden in Hepes-gepuffertem Ham’s F10 mit 80 IE Hyaluronidase und durch mehrmaliges Spülen der Eizellen in reinem Hepes-gepufferten Ham’s F10 (Flushing-Medium (Gück)). Die Mikroinjektion der Metaphase-II-Oozyten fand etwas später statt, ca. 4,5 Stunden nach der Follikelpunktion. Zuvor wurden alle reifen Oozyten in eine Petrischale, die Hepes-gepufferte Ham’s F10-Tropfen zu 5 µl enthielt, unter Paraffinöl umgesetzt.
Die Spermienaufbereitung erfolgte durch Waschen in Ham’s F10-Medium, 10-minütiger Zentrifugation bei 500 G und anschließendes swim up (soweit möglich). Etwa 0,8-1,0 µl der aufbereiteten Spermienflüssigkeit kam dann in einen 5-µl-Tropfen aus Polyvinylpyrrolidon (PVP) unter Paraffinöl.
Unter einem speziellen Mikroskop (Olympus IX 50), das mit Manipulatoren für die Mikroinjektion (Luigs & Neumann) ausgerüstet ist, erfolgte die Spermieninjektion der Oozyten. Dabei wurden die Oozyten mit der Haltepipette so gefasst, dass das Polkörperchen bei 6 Uhr zu liegen kam. Mit der Injektionspipette wurde dann jeweils ein immobilisiertes Spermatozoon bei 3 Uhr in die Eizelle injiziert. Anschließend erfolgte die Umsetzung der Eizellen in Ham’s F10-Medium (4-Well-Schälchen) und die Begasung mit 5% CO2 bei 37°C im Inkubator.
16 bis 18 Stunden danach wurden die Eizellen auf Fertilisationszeichen hin untersucht und nach weiteren 26 bis 28 Stunden erfolgte die qualitative Beurteilung der zu transferierenden Präembryonen nach der Klassifikation von Veeck [18]:

Grad 1 :
Präembryo mit Blastomeren gleicher Größe und keine zytoplasmatischen Fragmente
Grad 2 :
Präembryo mit Blastomeren gleicher Größe und kleineren zytoplasmatischen Fragmenten oder Bläschen
Grad 3 :
Präembryo mit ungleichgroßen Blastomeren ohne bzw. mit nur sehr wenigen zytoplasmatischen Fragmenten
Grad 4 :
Präembryo mit Blastomeren gleicher oder ungleicher Größe mit massiver zytoplasmatischer Fragmentation
Grad 5 :
Präembryo mit einigen Blastomeren unterschiedlicher Größe und kompletter Fragmentation

Nach dem intrauterinen Transfer (Edwards-Wallace-Embryotransferkatheter) von maximal 3 Präembryonen erhielten die Patientinnen zur Unterstützung der lutealen Phase 3mal täglich über 2 Wochen 200 mg Progesteron intravaginal (Utrogestan® (Labo Piette Intern.)) und, vorausgesetzt es boten sich keine Zeichen eines ovariellen Hyperstimulationssyndroms, zusätzlich am Transfertag 5.000 IE HCG i.m. (Pregnesin® (Serono)). War 2 Wochen nach Transfer der Schwangerschaftstest positiv, werteten wir dies als biochemische Schwangerschaft. Die Diagnose einer klinischen Schwangerschaft wurde ab der 5+0 SSW (21. Tag nach dem Transfer) mit dem Sichtbarwerden einer intrauterinen Fruchthöhle im vaginalen Sonogramm gestellt.
Zur Signifikanzberechnung diente in den Kontigenztafeln der Chi-Quadrat-Test, zum Teil mit Yates-Korrektur, und bei mathematisch zweifelhaftem Chi-Quadrat-Testergebnis zusätzlich der 2I-Test nach Kullback. Bei der statistischen Analyse von Häufigkeitsverteilungen wurde der Student’s t-Test herangezogen. Hinsichtlich der Aussagekraft der Ergebnisse muss erwähnt werden, dass nur 100 ICSI-Zyklen untersucht wurden und uns damit in den einzelnen Untergruppen nur kleine Fallzahlen zur Verfügung standen.

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Ergebnisse
Insgesamt wurden für ICSI 100 erfolgreiche transvaginale Punktionen durchgeführt. Dabei kam es bei einer Fertilisationsrate von 58,1% bei 93 Punktionszyklen zu einem Embryotransfer (93,0%). Klinische Schwangerschaften konnten bei 22 Patientinnen nachgewiesen werden. Das entspricht einer klinischen Schwangerschaftsrate von 23,7% pro Transfer.
Gewonnen wurden 1.014 Oozyten. Nach dem Freipräparieren waren 110 Oozyten (10,8%) beschädigt oder degeneriert. Von den restlichen 904 Eizellen befanden sich 811 in Metaphase II (89,7%), 67 in Metaphase I (7,4%) und bei 26 waren Germinal Vesicles (2,9%) sichtbar. Bei den Punktionszyklen, wo es zu einer klinischen Schwangerschaft kam, konnte mit 94,1% ein leicht signifikant höherer Anteil an Metaphase-II-Oozyten (chi 2=6,078, p=0,0479) nachgewiesen werden (versus 88,3%) (siehe Tabelle1) .
796 Metaphase-II-Oozyten wurden insgesamt behandelt. Dabei lag die durchschnittliche Zeitdauer zwischen Follikelpunktion und ICSI bei 4,5 Stunden. Unterteilt nach den Punktionszyklen mit und ohne klinische Schwangerschaft betrug bei den Punktionszyklen mit klinischer Schwangerschaft die durchschnittliche Zeit 3,4 Stunden (versus 4,8 Stunden, nicht signifikant, t=1,290566).
Von den 796 behandelten Metaphase-II-Oozyten waren 771 intrazytoplasmatische Spermieninjektionen (96,9%) und 25 subzonale Spermieninjektionen (3,1%). Bei den 771 ICSI’s erfolgten 742 Injektionen (96,2%) mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 29 mit Hepes-gepuffertem Ham’s F10-Kulturmedium (siehe Tabelle 2) .
Nach ICSI traten bei 448 Eizellen (58,1%) Pronuclei auf. Wurde die Injektion mit PVP durchgeführt, betrug die Fertilisationsrate 59,0%, nach Injektion mit Hepes-gepuffertem Ham’s F10-Kulturmedium 34,5%. Nach 25 ungewollten SUZI (auch mit immobilisierten Spermatozoen) ließ sich eine Fertilisationsrate von 16,0% feststellen (siehe Tabelle 3) .
502 ICSI’s liefen optimal, d.h. ohne sichtbaren Fehler (siehe Tabelle 4) . Von denen wurden 311 Eizellen befruchtet (62,0%) (Tabelle 5) . Bei den weiteren neun hier untersuchten Variationsmöglichkeiten der Spermatozooninjektion fanden wir die folgenden Ergebnisse:
Eine große Aspiration von Ooplasma bei der Spermieninjektion konnten wir bei 37 ICSI’s registrieren. Danach waren aber 28 Eizellen (75,7%) befruchtet. Zu einer mehrfachen Aspiration kam es bei 14 Oozyten. Die Fertilisationsrate lag hier bei 50,0% (n=7). Insgesamt wurde nur 1 nicht ganz immobilisiertes, d.h. noch mobiles Spermatozoon injiziert. Hier sahen wir keine Pronuclei. Rückwärts gelangten 7 Spermien in die Eizelle (57,1% befruchtet, n=4). Bei 5 Spermien wurde bei der Immobilisierung der Schwanz geknickt. 2 der mit diesen Spermien injizierten Eizellen zeigten Fertilisationszeichen. 25 Oozyten mussten mehrfach injiziert werden, wenn es z.B. zu Schwierigkeiten bei der Penetration des Oolemmas kam oder das Spermatozoon nach der ICSI ungewollt herausgezogen wurde. Befruchtet waren danach 32,0% (n=8). Bei zu forcierter Injektion traten in 60 Fällen PVP- oder Ham’s F10-Flecke in den Oozyten auf. Dies führte zu einer Fertilisationsrate von 51,7% (n=31). Nach Invagination (n=31), d.h. wenn sich der Einstichkegel nicht zurückbildete und das Spermatozoon in diesem Kegel zu liegen kam, konnten bei 22 Eizellen (71,0%) Pronuclei beobachten werden. Bei 60 Oozyten wurde bei der Spermieninjektion mit der Injektionspipette das gegenüberliegende Oolemma berührt. Hier ist die Fertilisationsrate mit 41,7% (n=25) deutlich niedriger.
Degenerationszeichen zeigten von 796 behandelten Oozyten nur 6,2% (n=49).
Von allen 238 transferierten Präembryonen konnten wir 51 (21,4%) dem Grad 1 zuordnen. 108 Präembryonen (45,4%) waren Grad 2, 48 (20,2%) Grad 3, 13 (5,5%) Grad 4 und 18 (7,6%) Grad 5. Durchschnittlich wurden 2,6 Präembryonen transferiert. 2,5 waren es bei den 71 Transferzyklen ohne nachfolgende klinische Schwangerschaft. Bei den Transferzyklen, wo es zu einer klinischen Schwangerschaft kam, betrug die durchschnittliche Anzahl an transferierten Präembryonen 2,7. Dieser Unterschied war aber nicht signifikant (t=1,026557). Ebenso konnten wir bei der Verteilung der transferierten Präembryonen nach den verschiedenen Qualitätsgraden keine signifikant bessere Präembryonenqualität (chi 2=7,0; p=0,1359) bei den Transferzyklen mit klinischer Schwangerschaft feststellen (siehe Tabelle 6) .

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Diskussion
Mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion wurde eine Methode entwickelt, die Paaren mit langjährigem Kinderwunsch bei schwerer andrologischer Subfertilität die Möglichkeit auf eigenen Nachwuchs gibt. Die andrologische Subfertilität dient aber als Indikation für ICSI nur dann, wenn entweder Spermiendichten von unter 3-5 Mio./ml vorliegen bzw. nicht davon ausgegangen werden kann, dass für die IVF mindestens 200.000 progressiv mobile, gereinigte Spermien pro Eizelle zur Verfügung stehen, oder es bei 1 bis 2 vorausgegangenen klassischen IVF-Versuchen bei ausreichender Oozytenanzahl nicht zu Fertilisationen kam. Als Indikation für ICSI gilt auch eine schwere elektronenmikroskopisch gesicherte Teratozoospermie. Weiterhin bestehen bei MESA (mikrochirurgische epididymale Spermien-Aspiration) und TESE (testikuläre Spermien-Extraktion) die besten Chancen auf Erfolg, wenn sich die intrazytoplasmatische Spermieninjektion dem anschließt [5, 10, 14, 15, 21].
Eine vergleichbare detaillierte Analyse der Variationsmöglichkeiten der Spermatozooninjektion findet sich in der internationalen Literatur nicht. Hinsichtlich Fertilisations-, Transfer- und klinischer Schwangerschaftsrate lassen sich unsere Ergebnisse mit denen der Gruppe um van Steirteghem [16] vergleichen. Dort liegt die Transferrate bei 90%, ähnlich unseren 93%. Dagegen erreicht unsere klinische Schwangerschaftsrate bei den ersten 100 Behandlungszyklen mit 23,7% pro Transfer nicht die Zahl von 39,2% der Brüsseler Arbeitsgruppe. Ähnlich ist aber ihre Fertilisationsrate mit 64,2% (versus 58,1%). Die Fertilisationsraten in anderen Veröffentlichungen bewegen sich zwischen 49,1% und 76,8% [7, 9, 12, 17].
Eine etwas höhere Fertilisationsrate konnten wir mit 62% nach ICSI’s ohne sichtbaren Fehler feststellen, d.h., man kann nach einer optimal verlaufenen ICSI in 2/3 aller Fälle davon ausgehen, dass nach ca. 16 Stunden (nach Nagy et al. [6] der optimale Zeitpunkt) die Eizelle zwei Pronuclei aufweist.
Noch höhere Fertilisationsraten sahen wir nach ICSI’s mit großer Zytoplasmaaspiration (75,7%) und nach ICSI’s mit Invagination (71,0%). Dagegen war nach Mikroinjektionen mit Berührung des gegenüberliegenden Oolemmas die Fertilisationsrate mit 41,7% ausgesprochen niedrig. Die Ursache hierfür könnte vielleicht die zu starke Verletzung des Zytoskeletts sein, wie das auch bei der Injektion noch mobiler Spermien angenommen wird. Einen Einfluß auf die Intaktheit der Eizellen nach der Mikroinjektion scheint dies aber nicht zu haben. Insgesamt zeigten nur 6,2% der behandelten Oozyten nach ca. 16 Stunden Degenerationszeichen. Somit lag dieses Ergebnis (93,8% intakte Eizellen) über dem allgemeinen Durchschnitt (83,7% [17], 84-90% [7]).
Bei uns wurde bei der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion stets darauf geachtet, dass das jeweils injizierte Spermatozoon vollständig immobilisiert war [1, 4, 9]. Nur in einem Fall kam es nicht zur vollständigen Immobilisierung. Über die Bedeutung der vollständigen Immobilisierung wurde bereits früher berichtet [1]. So lag die Transferrate bei Injektion noch mobiler Spermien bei nur 63,2% gegenüber 96,7% (jetzige Arbeit 93%) bei Injektion vollständig immobilisierter Spermien.
Von 904 Oozyten befanden sich 89,7% in der Metaphase II. Wurden diese 811 reifen Oozyten hinsichtlich des Behandlungsergebnisses unterteilt, konnte bei den Punktionszyklen, die zu einer klinischen Schwangerschaft führten, mit 94,1% (versus 88,3%) ein leicht signifikant höherer Anteil nachgewiesen werden. So scheint bei rund 90% reifen Oozyten dennoch eine weitere Verbesserung der Follikelstimulation zur Erreichung eines noch höheren Anteils an Metaphase-II-Oozyten sinnvoll, da sich das Verhältnis der reifen zu den unreifen Oozyten auf das Behandlungsergebnis auswirken kann.
Insgesamt hatten wir 26 Oozyten mit Germinal Vesicles. Diese unreifen Eizellen wurden demzufolge auch nicht injiziert. Es bestünde aber die Möglichkeit, in Fällen, wo überwiegend nur unreife Oozyten vorhanden sind, diese nachreifen zu lassen. Nach den Ergebnissen von Nagy et al. [8] konnten so 64% aller Germinal-Vesicle-Oozyten nach 30 Stunden zu Metaphase-II-Oozyten in vitro nachreifen, die dann nach ICSI auch eine normale Fertilisierung aufwiesen.
Hinsichtlich der Präembryonenqualität konnten wir im Gegensatz zu anderen Autoren wie Veeck [18, 19, 20], Erenus et al. [2], Puissant et al. [11] und Scott et al. [13] keinen signifikant besseren morphologischen Zustand der sich in Teilung befindlichen Präembryonen, bei den Transferzyklen, die zu einer klinischen Schwangerschaft führten, nachweisen.
Stellt man anhand der einzelnen Fertilisationsraten in Abhängigkeit von den Variationsmöglichkeiten der Spermatozooninjektion eine Fertilisierungsrangliste auf, so scheinen Injektionen mit großer Zytoplasmaaspiration die beste Fertilisierung mit 75,7% aufzuweisen, gefolgt von Injektionen mit Invagination (71%) und Injektionen ohne sichtbaren Fehler (62%). In bezug auf die Anzahl der injizierten Oozyten fanden wir mit 32% die schlechteste Fertilisationsrate bei Spermieninjektionen mit mehrfacher Oolemmapenetration (siehe Tabelle 7) .
Inwieweit diese Ergebnisse Ansatzpunkte zur Optimierung des Verfahrens sein können, lässt sich am Beispiel der angenommenen besten und schlechtesten ICSI-Bedingungen darstellen. So wäre nach den hier vorliegenden Ergebnissen der angenommene Idealfall, wenn die intrazytoplasmatische Spermatozooninjektion bis ca. 3-4 Stunden nach der Follikelpunktion durchgeführt wird, mehr als 90% reife Oozyten vorhanden sind und die Injektion mit PVP, ohne sichtbaren Fehler oder mit großer Zytoplasmaaspiration bzw. mit Invagination erfolgt (siehe Tabelle 8) .

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Literatur
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Bremer Zentrum für Fortpflanzungsmedizin
Prof. Dr. med. Ernst Heinrich Schmidt und
Dr. med. Olaf Drost
Frauenklinik, Evang. Diakoniekrankenhaus
gGmbH Bremen
Gröpelinger Heerstraße 406 / 408
28239 Bremen
Tel. (0421) 61 02-0, Fax (0421) 61 02-12 29

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